v
MỤC LỤC
CHƢƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm ơn iii
Tóm tắt iv
Mục lục v
Danh sách các chữ viết tắt ix
Danh sách các hình x
Danh sách các bảng xi
Danh sách các biểu đồ xii
Danh sách các sơ đồ xiii
1. MỞ ĐẦU 1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Yêu cầu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH 3
2.1.1. Khái niệm miễn dịch 3
2.1.2. Kháng nguyên 3
2.1.2.1. Định nghĩa 3
2.1.2.2. Khái niệm về epitop 3
2.1.3. Kháng thể dịch thể 4
2.1.3.1. Định nghĩa 4
2.1.3.2. Cấu trúc của một phân tử immunoglobulin 4
2.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của động vật 5
2.1.4.1. Loài động vật 5
2.1.4.2. Yếu tố di truyền 5
vi
2.1.4.3. Kháng nguyên 6
2.1.4.4. Qui trình gây miễn dịch 7
2.1.4.5. Chất bổ trợ 8
2.1.5. Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể 9
2.1.5.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể 9
2.1.5.2. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể 11
2.2. VI KHUẨN E. coli 14
2.2.1. Định nghĩa 14
2.2.2. Đặc tính sinh hóa 14
2.2.3. Yếu tố kháng nguyên 14
2.2.3.1. Kháng nguyên thân O 14
2.2.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K 15
2.2.3.3. Kháng nguyên lông roi H 15
2.3. TÁCH KHÁNG THỂ BẰNG AMMONIUM SULFATE 15
2.4. HỒI CHẾ KHÁNG THỂ BẰNG PHƢƠNG PHÁP THẨM TÍCH 16
2.5. PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ 17
2.5.1. Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) 17
2.5.2. Các đặc tính chung của sự liên kết KN-KT 17
2.5.3. Phản ứng ngƣng kết KN-KT 18
2.5.3.1. Phản ứng ngƣng kết KN-KT xảy ra theo 2 pha 18
2.5.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng ngƣng kết KN-KT 19
2.6. PROTEIN A 19
3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 21
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 21
3.1.1. Thời gian thực nghiệm 21
3.1.2. Địa điểm 21
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 21
3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 21
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
3.4.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ 22
3.4.1.1. Chuẩn bị dịch tiêm 22
3.4.1.2. Tiêm thú thí nghiệm 22
vii
3.4.1.3. Bố trí thí nghiệm 23
3.4.2. Thu nhận kháng huyết thanh 25
3.4.2.1. Tách kháng thể bằng amonium sulfate bão hoà 26
3.4.2.2. Phục hồi kháng thể 26
3.4.3. Xử lí kháng huyết thanh 27
3.4.3.1. Hấp phụ kháng thể không đặc hiệu 28
3.4.3.2. Gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus 29
3.4.4. Đánh giá 30
3.4.4.1. Định tính (bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính) 30
3.4.4.2. Định lƣợng (định hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong
ống nghiệm) 31
3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI 32
3.6. XỬ LÍ KẾT QUẢ 32
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
4.1. KẾT QUẢ 33
4.1.1. Định tính 33
4.1.1.1. Qui trình ngắn ngày 33
4.1.1.2. Qui trình dài ngày 34
4.1.2. Định lƣợng 34
4.1.2.1. Qui trình ngắn ngày 35
4.1.2.2. Qui trình dài ngày 36
4.1.2.3. Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch ở 2 qui trình 37
4.1.3. Xử lí tăng độ nhạy của kháng huyết thanh 38
4.1.3.1. Xác định nồng độ S. aureus thích hợp gắn với kháng huyết thanh . 38
4.1.3.2. Kiểm tra phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh xử lí gắn
S. aureus 38
4.1.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh 40
4.2. THẢO LUẬN 42
4.2.1. Định tính 42
4.2.2. Định lƣợng 43
4.2.2.1. Qui trình ngắn ngày 43
4.2.2.2. Qui trình dài ngày 43
viii
4.2.3. Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết thanh 44
4.2.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh 44
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46
5.1. KẾT LUẬN 46
5.2. ĐỀ NGHỊ 46
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
7. PHỤ LỤC 49
ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APC Antigen-presenting cell
(Tế bào trình diện kháng nguyên)
E. coli Escherichia coli
Ig Immunoglobulin
(Globulin miễn)
IL Interleukine
KHT Kháng huyết thanh
KN Kháng nguyên
KT Kháng thể
KN-KT Kháng nguyên – Kháng thể
MHC II Major histocompatibility complex class II antigens
(các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II)
S. aureus Staphylococcus aureus.
SIg Surface immunoglobulin
(Globulin miễn màng tế bào)
TCR T cell receptor
(Thụ quan bề mặt tế bào T)
T
H
lympho T helper cell
(tế bào lympho T hỗ trợ)
x
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1 Cấu trúc tổng quát phân tử kháng thể 4
Hình 2.2 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu lộ trên
bề mặt tế bào 10
Hình 2.3 Phức hợp KN- MHC lớp II gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4
+
trên tế
bào T
H
10
Hình 2.4 Cấu trúc đặc trƣng của tế bào tƣơng 11
Hình 2.5 Đáp ứng của tế bào B với kháng nguyên và mối liên hệ giữa sự đáp ứng
này với hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh 12
Hình 2.6 Sự khác biệt giữa KN phụ thuộc tuyến ức và KN không phụ thuộc tuyến
ức trong kích hoạt đáp ứng ở tế bào B 13
Hình 2.7 Đáp ứng tạo kháng thể khác nhau tùy vào KN phụ thuộc tuyến ức hay
không phụ thuộc tuyến ức. KN không phụ thuộc vào tuyến ức không
gây ra sự thay đổi từ sản xuất IgM sang IgG 13
Hình 2.8 Trên bao thẩm tích có các lỗ nhỏ cho phép các phân tử muối đi ra ngoài
còn KT bị giữ lại 17
H ình 2.9 Phản ứng ngƣng kết do kháng thể tạo nên 19
Hình 2.10 Kháng thể IgG gắn với protein A của S. aureus 20
Hình 3.1 Tủa kháng huyết thanh 26
Hình 3.2 Dịch kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate trƣớc và sau thẩm
tích 27
Hình 3.3 Phản ứng ngƣng kết trên phiến kính 30
Hình 3.4 Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm 32
Hình 7.1 Thỏ nuôi thí nghiệm 50
Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai 50
Hình 7.3 Tiêm dƣới da 50
xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 3.1 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình ngắn ngày 23
Bảng 3.2 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình dài ngày (qui trình viện
Pasteur Tp. HCM) 24
Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết
thanh của thỏ 1 và thỏ 2 33
Bảng 4.2 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết
thanh của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 34
Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh
thỏ 1 và thỏ 2 35
Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh thỏ 3 và
thỏ 4 36
Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ ở
qui trình ngắn ngày và dài ngày 37
Bảng 4.6 Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh gắn
S. aureus ở các nồng độ khác nhau 38
Bảng 4.7 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết
thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 1 và thỏ 2
39
Bảng 4.8 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết
thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 3, thỏ 4 và
thỏ 5 39
Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp
phụ của thỏ 1 và thỏ 2 (qui trình ngắn ngày) 40
Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp
phụ của thỏ 3 và thỏ 4 (qui trình dài ngày) 41
xii
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
BIỂU ĐỒ TRANG
Biểu đồ 4.1 Biến đổi hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của
thỏ 1 và thỏ 2 theo thời điểm lấy mẫu 35
Biểu đồ 4.2 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã
thẩm tích của thỏ 2 36
Biểu đồ 4.3 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 3 và
thỏ 4 ở các thời điểm khác nhau 36
Biểu đồ 4.4 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã
thẩm tích của thỏ 4 37
Biểu đồ 4.5 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc không
đƣợc hấp phụ của thỏ 1 và thỏ 2 ở qui trình ngắn ngày 41
Biểu đồ 4.6 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc không
đƣợc hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 ở qui trình dài ngày 42
xiii
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
SƠ ĐỒ TRANG
Sơ đồ 3.1 Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli 22
Sơ đồ 3.2 Qui trình chung về xử lí kháng huyết thanh 25
Sơ đồ 3.3 Qui trình hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu 28
Sơ đồ 3.4 Qui trình gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus 29
Sơ đồ 3.5 Qui trình chuẩn bị dịch kháng nguyên thực hiện phản ứng ngƣng kết
chậm trong ống nghiệm 31
1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong chăn nuôi việc chẩn đoán, phát hiện bệnh sớm để điều trị kịp thời sẽ làm
giảm đáng kể những thiệt hại gây ra về kinh tế cũng nhƣ sức khỏe của ngƣời tiêu dùng.
Tùy theo từng tác nhân gây bệnh mà có các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh khác nhau.
Thông thƣờng để chẩn đoán bệnh do vi sinh vật ngƣời ta dùng phƣơng pháp cổ điển là
nuôi cấy phân lập tế bào vi sinh vật, định danh chúng bằng các phản ứng huyết thanh
học. Kĩ thuật hiện đại nhƣ PCR (Polymerase Chain Reaction) có độ nhạy và độ đặc
hiệu cao hơn các phƣơng pháp kinh điển do đó giúp chẩn đoán nhanh và chính xác
hơn. Nhƣng kĩ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên liệu riêng, đắt tiền, kĩ
thuật thực hiện còn phức tạp, cán bộ kĩ thuật phải có trình độ kĩ thuật nhất định.
Các kĩ thuật chẩn đoán miễn dịch học mà điển hình là kĩ thuật ELISA (Enzyme-
linked immunosorbent assay) cũng tỏ ra rất hiệu quả trong việc chẩn đoán nhanh và
chính xác các vi sinh vật gây bệnh không thua kém phƣơng pháp PCR. Nguyên tắc của
kĩ thuật này dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu. Dựa
vào nguyên tắc này các nhà sản xuất tạo ra các bộ kít chẩn đoán phát hiện vi sinh vật
gây bệnh để ngƣời chăn nuôi có thể tự mình kiểm tra xem vật nuôi có mang mầm bệnh
hay không nhƣ bộ kit chẩn đoán bệnh đốm trắng cho tôm
Hiện nay ở Việt Nam việc sản xuất kháng huyết thanh và kháng thể phục vụ cho
việc chẩn đoán bệnh bằng miễn dịch học trong chăn nuôi còn ít, chỉ mới áp dụng cho
một số bệnh.
Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó chúng tôi đi vào nghiên cứu đề tài “Thử nghiệm
sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn E. coli” để phục vụ cho việc chẩn đoán
nhanh và điều trị bệnh kịp thời. Ngoài ra có thể ứng dụng vào sản xuất kháng huyết
thanh kháng các vi sinh vật gây bệnh quan trọng khác.
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét